加味左金丸对胃癌前病变大鼠胃粘膜癌基因EGFR、VEGF、C-met、Bcl-2蛋白表达的影响
加味左金丸对胃癌前病变大鼠胃粘膜癌基因EGFR、VEGF、C-met、Bcl-2蛋白表达的影响2006-4-20 16:19:34 湖北省中医院消化内科（430061）胡运莲 李天望 童昌珍
癌变过程不仅存在细胞增生异常,而且也存在细胞凋亡异常。细胞增生与凋亡是受基因控制的，原癌基因的激活是其重要原因。原癌基因产物表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子受体(C－met)、凋亡抑制因子-2(Bcl-2)分别与细胞增生或凋亡关系的研究已有较多报道，但4个同时研究的报道尚未见。加味左金丸是全国第二批名老中医药专家程丽芳教授的经验方，原汤剂临床应用30余年，治疗慢性萎缩性胃炎癌前病变疗效肯定。先期通过动物实验证实加味左金丸能逆转大鼠胃癌前病变。本实验即在研究胃癌前病变大鼠胃粘膜癌基因EGFR、VEGF、C-met、Bcl-2蛋白表达情况及加味左金丸对其影响以探讨其可能的治疗机理。
1 材料与方法
1.1主要药品、试剂及仪器
甲硝基亚硝基胍（MNNG）为Fluka 公司产品，用双蒸水配成1g/L的母液4℃避光储存，每周配一次，临用时用双蒸水配成所需浓度；脱氧胆酸钠购自湖北省医药公司；维甲酸由上海第六制药厂生产；雷尼替丁由杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司生产；75%乙醇，用双蒸水稀释成40%的浓度；加味左金丸水煎液由黄连6g、吴朱萸6g、党参10g、茯苓10g、醋柴胡10g、白芍15g、法半夏10g、三七粉3g(冲)、莪术10g、白花蛇舌草15g、百合10g、炙甘草6g组成，由湖北省中医院中药制剂室供给，浓度为2g/ml。
即用型EGFR、VEGF、C-met、Bcl-2免疫组织化学染色SP试剂盒， EGFR、VEGF、C-met、Bcl-2多克隆抗体，DAB即用型显色试剂盒，均购自北京中山生物技术公司。全自动图像分析仪由武汉大学医学院病理教研室提供，软件为同济千屏影像工程公司HPIAS2000型图像分析软件。
1.2 造模及给药方法
选用SPF级6周龄SD雄性大鼠60只，体重100-120g（武汉市疾病预防控制中心提供）。造模参照严茂祥综合造模方法并加以改进。大鼠自购进后适应性喂养1周。从60只大鼠中随机抽取10只作为正常组，其余50只用于造模。正常组大鼠不做任何处理。造模大鼠自购进的第2周起每日自由饮用100ug/mlMNNG液(饮料瓶用油漆涂黑避光)、进食含0.03%雷尼替丁的纯鼠饲料、上午用56℃、15%的氯化钠液按10ml/kg灌胃，并采取进食2d、禁食1d饥饱相间的方法，进食当天下午用0.85%脱氧胆酸钠溶液按10ml/kg灌胃，禁食当天下午用40%乙醇按10ml/kg灌胃，共 24周。24周末时随机抽取正常组和造模大鼠各一只，杀检，观察组织病理学变化（以HE染色光学显微镜下观察的结果为主），确认模型是否成功。
模型成功后，将造模存活的43只大鼠随机分为自然恢复组11只，维甲酸组8只，加味左金丸高、中、低剂量组（简称高、中、低剂量组）各8只。高剂量组每日每只按20g/kg（相当于成人一日用量的2倍）灌胃，中剂量组按10g/kg（相当于成人一日用量）灌胃，低剂量组按5g/kg（相当于成人一日用量的一半）灌胃。维甲酸组按40mg/kg灌胃。上述治疗16周。自然恢复组同正常组大鼠常规饮食。40周末所有动物禁食1d，处死，剖腹取胃，沿胃大弯剪开，生理盐水冲洗，肉眼观察，平铺于硬纸板上，于胃窦部剪取组织1块，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片5um，免疫组织化学染色。
1.3检测方法
PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性切片作阳性对照。免疫组化染色阳性为棕色或黄褐色。EGFR定位于胞浆及胞膜上；VEGF定位于细胞浆；C-met定位于细胞浆；Bcl-2定位于胞浆或胞膜。采用显微摄像计算机图像分析系统。数5个以上高倍视野,不少于1000个细胞。
EGFR染色结果以阳性百分率表示,并根据染色深浅和阳性细胞百分数,将阳性强度判为(+)弱阳性(0～25%),(++)中等度阳性(25%～50%),(+++)强阳性(>50%)。VEGF阳性细胞按如下方法统计，(-)：无阳性细胞或阳性细胞＜5%；(+)：阳性细胞数为5%～20%；(++)：阳性细胞数为20%～60%；(+++)：阳性细胞数为>60%。C-met阳性细胞按如下方法统计， (-)：无阳性细胞或阳性细胞＜30%；(+)：阳性细胞数为30%～50%；(++)：阳性细胞数为50%～80%；(+++)：阳性细胞数为>80%。bcl－2阳性细胞按如下方法统计：＜10%为阴性，≥10%定为阳性。 1.4统计学处理方法 计数资料采用均采用x2检验，等级计数资料采用ridit分析。
2．结果(1) 各组大鼠胃粘膜EGFR蛋白表达见表1
表1EGFR蛋白表达比较组别总例数EGFR－ ＋ ＋＋ ＋＋＋ 阳性例数（率）
正常组981001（11.1%）自然恢复组502305（100%）维甲酸组853003（37.5%）◆高剂量组862002(25%）▲★中剂量组880000（0%）●★低剂量组871001（12.5%）▲★注：①实验结束时自然恢复组共死亡6只，未列入统计。②与自然恢复组比，▲P＜0.05，●P<0.01，◆P>0.05；各治疗组(高中低)与维甲酸组比，★P>0.05
正常大鼠胃窦粘膜即有EGFR蛋白表达，主要分布在靠近腺体基底部的增殖细胞中，呈弥漫性胞浆表达。加味左金丸各治疗组EGFR蛋白阳性例（率）与自然恢复组比较差异有统计学意义 (中剂量组P<0.01或高、低剂量组P<0.05)；维甲酸组EGFR蛋白阳性例（率）与自然恢复组比较差异无统计学意义（P>0.05）；加味左金丸各治疗组EGFR蛋白阳性例（率）与维甲酸组比较差异无统计学意义（P>0.05）。(2) 各组大鼠胃粘膜VEGF蛋白表达见表2 表2 VEGF蛋白表达比较组别总例数VEGF－ ＋ ＋＋ ＋＋＋ 阳性例数（率）
正常组99
0 000（0）
自然恢复组503 205（100%）
维甲酸组862 002（25%）▲
高剂量组853 003(37.5%）◆★
中剂量组871 001（12.5%）▲★
低剂量组862 002（25%）▲★
注：①实验结束时自然恢复组死亡共6只，未列入统计。②与自然恢复组比，▲P＜0.05，◆P>0.05；各治疗组(高中低)与维甲酸组比，★P>0.05。VEGF染色阳性定位于细胞浆。正常大鼠胃粘膜没有VEGF蛋白表达。自然恢复组5例全呈阳性表达，阳性率100%。加味左金丸中、低剂量组VEGF蛋白阳性例（率）降低与自然恢复组比较差异有统计学意义 (P<0.05)，高剂量组与之比较差异无统计学意义（P＞0.05)；维甲酸组VEGF蛋白阳性例（率）与自然恢复组比较差异有统计学意义 (P<0.05)；加味左金丸高、中、低剂量组VEGF蛋白阳性例（率）与维甲酸组比较差异无统计学意义（P>0.05）。
(3) 各组大鼠胃粘膜C-met蛋白表达见表3表3 C-met基因蛋白表达比较
组别总例数C-met－ ＋ ＋＋ ＋＋＋ 阳性例数（率）正常组981001（11.1%）自然恢复组502305（100%）维甲酸组833205（62.5%）▲高剂量组834105(62.5%）▲中剂量组853003（37.5%）▲低剂量组844004（50%）▲注：①实验结束时自然恢复组死亡共6只，未列入统计。②与自然恢复组比，▲P＞0.05。C-met染色阳性定位于细胞浆。正常大鼠胃粘膜可有C-met蛋白表达，主要分布在腺颈部。自然恢复组大鼠5例全呈阳性表达，阳性率100%。加味左金丸高、中、低剂量组及维甲酸组C-met蛋白阳性例（率）与自然恢复组比较差异无统计学意义 (P＞0.05)；加味左金丸高、中、低剂量组C-met蛋白阳性例（率）与维甲酸组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
(4) 各组大鼠胃粘膜Bcl-2蛋白表达见表4。 表4 各组胃粘膜Bcl-2蛋白表达比较
组别总例数Bcl-2阳性细胞例（率）正常组90（0）自然恢复组55(100%)维甲酸组81(12.5%)▲高剂量组81(12.5%)▲●中剂量组80(0)▲●低剂量组82(25%)■●注：①实验结束时自然恢复组死亡共6只，未列入统计。
②Bcl-2阳性细胞例（率）：与自然恢复组比，■P<0.05, ▲P<0.01；与维甲酸组比：●P>0.05。
Bcl-2染色阳性定位于胞浆。正常组大鼠Bcl-2蛋白无阳性表达；自然恢复组大鼠5例全呈阳性表达，阳性率100%；加味左金丸高、中剂量组和维甲酸组Bcl-2蛋白表达降低，与自然恢复组比较差异有统计学意义（P<0.01），加味左金丸低剂量组与自然恢复组比较差异有统计学意义（P<0.05）；加味金丸高、中、低剂量组和维甲酸组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
3．讨论
1994年加拿大Schipper对经典肿瘤模式提出了新认识，认为恶变特征是由于少数基因和环境变化的结果，癌变的过程特点是调控失常，并且这种癌变过程有潜在逆转可能；对癌症的治疗应通过调整机体对它们的控制，而不是必须杀死所有癌细胞。这种认识与中医的整体观点相吻合。针对胃粘膜的癌变而言，目前，一致认可的演变模式为：慢性浅表性胃炎（CSG）→慢性萎缩性胃炎（CAG）→胃黏膜肠上皮化生（IM）→胃黏膜不典型增生（Ｄys）→胃癌（GC）。1978年世界卫生组织将CAG称之为癌前疾病或癌前状态，将在CAG基础上伴发的IM及ATP称之为胃癌前病变，后者只是一个病理学概念。众多研究表明，在胃癌前病变阶段已存在多种癌基因、抑癌基因的结构、表达异常，使细胞异常增殖、凋亡和增殖凋亡平衡失调，进而导致胃癌的发生。本研究则旨在探讨大鼠胃癌前病变阶段癌基因产物EGFR、VEGF、C-met、Bcl-2蛋白表达情况及中药加味左金丸对其基因的调控影响。
EGFR是原癌基因C_erbB-1的表达产物,它与相应的配体结合后发挥其调节细胞生长的作用。有研究表明,正常大鼠胃粘膜中存在EGFRｍRNA表达,表明正常胃粘膜具有合成EGFR的能力，这对维持胃粘膜细胞的正常生长更替是必要的；在胃癌前病变阶段EGFR蛋白的表达与胃癌无差异,提示EGFR蛋白表达阳性的胃癌前病变可能有较高的癌变易感性。VEGF是促进血管增生和形成的最重要的因子之一，大量的研究报道多集中在其与肿瘤生物学行为方面的关系，是一晚期行为；但也有部分研究表明它在胃癌前病变阶段即存在较高表达，在胃癌的发生中即早期阶段可能起了一定的作用。 C-met是C-met原癌基因的表达产物，称为肝细胞生长因子(HGF)的受体，通过与HGF结合参与了肿瘤细胞增殖与移动的信号转导过程。有研究显示，C-met蛋白在正常胃粘膜的腺颈部可呈现阳性表达，提示与胃粘膜上皮的更新与修复活动有关；在胃癌前病变已有较高表达，反映胃黏膜细胞的增殖状态并具有恶变倾向，是胃癌发生中的早期事件。Bcl-2是目前研究最多的一种凋亡拮抗基因，主要通过延长细胞寿命而导致异常细胞的积聚进而阻止凋亡的发生。众多研究结果显示从正常胃粘膜－CAG－IM－Ｄys－GC中，Bcl-2的表达逐渐上升，与癌变前期过程有关，参与胃癌的启动和胃癌形成的早期, 与肿瘤进展无关。
本实验研究显示正常大鼠胃粘膜有少许EGFR和C-met蛋白表达，其中，EGFR主要分布在靠近腺体基底部的增殖细胞中，C-met主要分布在腺颈部细胞，但没有VEGF、Bcl-2蛋白阳性表达；模型大鼠胃粘膜EGFR、VEGF、C-met、Bcl-2蛋白表达率均100%；加味左金丸各组能不同程度地降低EGFR、VEGF、Bcl-2蛋白的表达，均以中剂量为优，但对C-met基因蛋白的表达作用不明显。提示在大鼠胃癌前病变阶段即存在EGFR、VEGF、C-met、Bcl-2基因的激活，也可能是MNNG为主要工具药诱发大鼠胃癌前病变的重要原因；加味左金丸则可能是通过对抗C_erbB-1、VEGF、Bcl-2基因的激活，抑制EGFR、VEGF、Bcl-2蛋白的表达，抑制细胞增殖、诱导“病态”细胞尽早凋亡，以恢复细胞凋亡与增殖平衡而发挥治疗胃癌前病变的作用。这种多基因调控可能与中药多成分、中医整体调节优势有关，是加味左金丸治疗或逆转大鼠胃癌前病变的机理之一。
维甲酸是细胞分化诱导剂，对癌前期病变具有部分阻断和逆转作用。本实验也表明维甲酸与加味左金丸一样对胃癌前病变大鼠胃粘膜VEGF、Bcl-2蛋白表达具有明显的抑制作用，但对降低EGFR、C-met蛋白的表达作用不明显。
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